为什么CAR-T细胞抗白细胞的活性可以维持10年？

故事在12年前开始。

2010年，以CD19为靶点的CAR-T细胞疗法（CTL019）启动了一期临床试验，并首次用于治疗CLL。前两名患者经过十多年疾病持续完全缓解，并且可以持续检测到CAR-T细胞。

患者1的CTL019扩增在第3天达到峰值，患者2在第31天达到峰值。这种延迟可能是由于患者2细胞剂量低了78倍。然而，这种差异的影响并不显著，两名患者10年多时间里都保持完全缓解。

在最新的血液检测中（1号患者10年后，2号患者9年后），仍能在两名患者中检测到CTL019细胞，分别占总T细胞的0.8%和0.1%。

流式细胞术显示，在CTL019输注三年后，CD19+B淋巴细胞和CLL细胞要么检测不到，要么被抑制到非常低的水平（不到细胞的1%）。

图1：1号患者（顶部）和2号患者（底部）。红色三角形表示CAR-T细胞，蓝色圆点表示抗CAR抗体的流式细胞术染色，蓝色方形表示细胞治疗后的B细胞数量。总的来说，CLL和B细胞已经连续被抑制了十年，数量很少；CAR-T细胞一直存在。

那么，到底是什么样的CAR-T细胞在患者体内停留了10年？

为了了解这些CAR-T细胞的克隆特征，研究人员以分类后的CAR-T细胞为研究对象，并使用深度测序来检测TCR b链库（TCR-seq）以及CAR-T细胞中的慢病毒载体整合位点（LVIS）。

在1号患者（0-9年）和2号患者（0-7.2年）的CAR-T细胞基因组中，研究人员分别发现7930和3406个独特的CAR载体整合位点；在最初制备的CAR-T细胞中，分别有3378个和1216个整合位点作为基线。无论是最初的CAR-T还是以后的时间点，大多数插入都被整合到基因中，并且整合到内含子中的概率高于其他部位。

LVIS数据显示，1号患者的CAR-T克隆组成在前1.6年并不稳定；1.9年后变得相对稳定。2号患者的CAR-T克隆组成在第31天到第1年以及1年到5年期间相对稳定。

在1号患者9.4个月至1.9年的阶段，出现了FOXP1、ZNF44、RHODMTOR、BCAP31、ZNF598和NPRL3等基因整合的CAR载体克隆。LSM4和CSNK2A基因整合位点在8.2-9.0年出现。

2号患者出现了SRCAP、PATL1和KCTD3整合位点克隆，这些克隆在前两年最为显著；ZZEF1持续超过7年。

这些数据表明，两者的基因整合点并不重叠。

图2. 患者1（左）和2（右）的不同整合部位随时间变化（至少有一个时间点>10%）。

接下来，每个人都想知道，在患者的不同时间点，这种有效的CAR-T细胞的表型是什么？它们各自的特点是什么？

为了回答这个问题，研究人员使用质量细胞仪（CyTOF）检测了40种抗体在不同时间点的CAR-T细胞表型。实验选择CD3+CAR+T细胞进行分析，每个时间点至少包括100个代表性细胞。

首先观察患者1，在再融合1.8个月时，CD8+细胞占所有CAR-T细胞的29.3%，并在随后的一段时间内逐渐减少。到1.4年，CD4+占CAR-T细胞的97.5%；在3.4年到9.3年之间，CD4+达到了99.6%。

虽然2号患者的CAR-T细胞扩张有一定的延迟，但也显示出类似的趋势：CD8+在开始时占很大比例，随着时间的推移，CD4⁺出现的较晚，7.2年后占CAR-T成分的97.6%。。

此外，在2号患者中也检测到大量CD4–CD8–双阴性CAR-T细胞，在2.5个月和1.6年时分别占所有CAR-T细胞的33.4%和46.5%，并随着时间的推移逐渐减少。

这些CD4–CD8–CAR-T细胞有一种特殊的表型：尽管双阴性，但它们表达细胞毒性标记物，如GZMB、2B4、CD57、CD85j、T-bet、PD-1和Helios。其中，Helios的表达是区分CD8⁺T细胞的标志，因此这组细胞被称为CD4^-CD8^-Helios^hiCAR-T细胞。

图3.CyTOF分析显示，在不同时间点的两名患者样本中，CD3+CAR+T细胞共包含五个主要细胞亚群：CD4⁺、CD4⁺Ki67^hi、CD8⁺GZMK、CD8⁺GZMB和CD4^-CD8^-Helios^+hiCAR-T细胞。

CD4⁺ CAR-T细胞高表达Ki67，表明它们处于增殖状态。Ki67^hi CD4⁺ CAR-T细胞作为两名患者的主流细胞群一直保持稳定：1号患者1.8个月时该细胞群占所有CAR-T细胞的15.9%，9.3年增加到97%。

CD8⁺CAR-T细胞也表现出类似的增殖趋势，但Ki67的表达相对低于CD4⁺ CAR-T细胞。这些Ki67^hi CD4⁺ CAR-T细胞具有特异性表达特征，包括激活标记物CD38、HLA-DR和CD95、转录因子EOMES和TOX、免疫检查点标记物CTLA-4、LAG-3和TIGIT，以及记忆细胞标记物CD27和CCR7。

图4. 在五个CAR-T细胞亚群中，CyTOF检测到各组的标记物表达水平。

综上所述，这些数据表明，患者对CAR-T细胞治疗的反应包括两个阶段：（1）以CD8⁺ T细胞和CD4^-CD8^-Helios^hiCAR-T细胞为代表的初始反应阶段，以及（2）以细胞毒性增殖CD4⁺CAR-T细胞为主的长期缓解阶段。

这些已经工作了十年的Ki67^hiCD4⁺CAR-T细胞如何实现超长待机时间并如此有效？

接下来，研究人员在单细胞水平上分析了这组特定CAR-T细胞的克隆组成、蛋白质表达和转录组。

研究人员使用CD3⁺CAR⁺DAPI^-细胞构建了单细胞TCR-seq和CITE-seq文库，并通过严格的筛选条件获得了1437个T细胞的单细胞特征。其中1149个是CAR-T细胞，288个是不表达CAR的普通T细胞。

普通T细胞非常多样化，288个细胞检测到170种不同的克隆类型；CAR-T显示出强大的克隆优势，1149个细胞仅包括27个克隆类型，其中前三个克隆占90%的CAR-T细胞。

在转录水平上，CAR-T细胞表现出明显的增殖特征，表达PCNA、MCM6、TOP2A、CDK1、CCDNB2和MKI67。

研究人员还发现，大约30%的CAR-T细胞处于S期、G2期或M期，而非CAR-T细胞不到7%

此外，与非CAR-T细胞相比，9.3年的CAR-T细胞也显示出其独特的特性。CITE-seq显示活化标记物CD38和HLA-DR在CAR-T细胞中高度上调，而抑制性受体如PD-1、TIM-3、LAG-3和TIGIT也上调。它们可能不仅与衰竭有关，还与T细胞激活状态有关。

通过比较G1期的CAR⁺和CAR^-CD4⁺细胞，研究人员确定了645个差异表达基因，其中上调的基因是CD4+效应T细胞的特征。

值得注意的是，在CD4⁺CAR-T细胞中检测到细胞毒性相关酶蛋白的上调，例如编码颗粒酶的GZMK和GZMA。编码穿孔素的PRF1也上调。

图5.显著上调基因的相关途径和基因富集分析

为了直接测量这些长效CD4⁺CAR-T细胞的功能活性，研究人员通过与表达CD19抗原的K562细胞与1号患者的T细胞共培养，特异性地刺激CAR-T细胞。在CAR的抗原刺激下，脱颗粒标记物CD107a上调，同时表达的基因有MIP-1b、穿孔素和颗粒酶A，表明这些CD4⁺的CAR-T细胞具有直接的细胞毒性功能。

上述结果表明，这些CAR-T细胞在功能上表现出激活特性，而不是衰竭。与此一致，编码细胞因子IL-10和IL-32的基因在CAR-T细胞中的表达也上调。GAPDH在所有细胞周期阶段的CAR-T细胞中均上调，而LDHA和氧化磷酸化途径仅在活跃细胞周期的细胞中上调，表明有氧糖酵解和线粒体依赖的氧化磷酸化可为CAR-T细胞增殖提供能量支持。

图6. CAR-T细胞维持长期肿瘤抑制效应的机制模型。

以上是患者1的9.3年的数据。

在第二位患者中是否也存在表达GZMA和GZMK的长效CD4⁺CAR-T细胞？

通过检查6.5年时2号患者的样本，CITE-seq分析发现153个高质量的CAR-T细胞，其CD4⁺CAR-T细胞群与9.3年时1号患者非常相似。

总的来说，这两名患者都有针对CD19的超长CAR-T细胞，在10多年后仍然可以检测到，并且都保持了疗效。

这些研究丰富了对CAR-T细胞治疗白血病的长期疗效的理解，这些发现将为未来的长效CAR-T研究带来新的思路。

正如Carl June博士所说：“我们现在可以得出结论，CAR-T细胞可以治愈白血病”。

来源：生物前哨

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